細胞數量確定

1.將細胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養箱中預孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

3.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

4.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

細胞增殖和細胞毒性測定

1.將種子細胞以103-104個細胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養基中培養。將細胞在CO2培養箱中于37℃培養24小時。

2.將不同濃度的待測物質加入板中。

3.將培養板在培養箱中孵育適當的時間（例如，6,12,24或48小時）。

4.使用重復移液器向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

5.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動器上輕輕混合1分鐘，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

數據分析

統計分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細胞數量，我們提供其中一種方法。

細胞存活率（％）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As=實驗孔吸光度（含有細胞，培養基，CCK-8和待測化合物的孔的吸光度）。

Ab=空白孔吸光度（含有培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac=對照孔吸光度（含有細胞，培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作標準曲線

1.細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數。

2.使用培養基，等比稀釋細胞懸液為一個濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個復孔。然后接種細胞。（注意每孔的細胞數量。如果您將細胞懸液稀釋在管中，在加入培養板的孔之前，請小心再次混勻細胞。每孔中細胞懸液的體積應該是一致的。）

3.培養直至細胞貼壁（通常2-4小時），然后每100μl培養基加入10μl CCK-8。繼續孵育1-4小時，用酶標儀測量450nm處的吸光度。制作出一條以細胞數為X軸坐標，O.D.值為Y軸坐標的標準曲線。

可以基于該曲線確定待測樣品的細胞數。使用此標準曲線的先決條件是培養檢測條件相同。

注意事項

1.確保藥物和CCK8均勻分布在培養基中。

2.細胞增殖越多,顏色越深;細胞毒性越強，顏色越淺。

3.對于貼壁細胞，每孔至少需要1000個細胞（100μl培養基）。對于白細胞，由于靈敏度較低，每孔至少需要2500個細胞（100μl培養基）。推薦的96孔板每孔最大細胞數為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數，并調整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。

4.因為CCK8測定是基于活細胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能導致實際活細胞數與使用CCK-8測定活細胞數之間有差異。

5.WST-8可能與還原劑反應生成WST-8 formazan。如果使用還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。

6.孵育2小時后，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。

7.注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.值。

8.如果您想對CCK8溶液進行滅菌，請使用0.2μm的膜過濾溶液。

9.孵育時間因孔中細胞的類型和數量而異。通常，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（長達4小時）或大量細胞（~105細胞/孔）。

10.如果細胞懸液中存在高濁度,測量并減去樣品在600nm或更高波長的O.D值。

11.CCK8不能用于細胞染色。

12.培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

13.CCK8的毒性非常低，在CCK8測定完成后，相同的細胞可用于其他細胞增殖測定，例如結晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為稀少，不推薦。）

14.該試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母細胞。

15.在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。

16.我們建議將細胞接種在靠近培養板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養基容易蒸發，可以用PBS，水或培養基填充這些孔。

17.如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片,450nm濾光片具有最佳靈敏度。

18.測量450nm處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定650nm處的吸光度。

19.藥物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。