微生物操作中常見問題的討論與分析

    1、劃不出單個菌落的原因：

    （1）平板上有過多的水分；

    （2）劃線時接種環未經反復灼燒；

    （3）多區劃線，三區或四區劃線。

    2、涂布和傾注的區別：

    涂布利于觀察，但由于涂布棒上會帶有少量的菌液，可能影響計數的準確性；傾注更為準確，但不利于觀察菌落的狀態。

    Beuchat和Matsuda等人分別對這兩種方法作了大量比較試驗后發現，對霉菌計數來說，涂抹法有以下幾方面優y越于傾注法：

    ①培養出的霉菌菌落數較多；

    ②培養所需的時間較短；

    ③霉菌孢子、菌落形態特征發育完w全，便于鑒定。

    這是因為絕大多數霉菌是好氧的，在培養基表面生長快，發育好，而混在培養基中發育就受影響，而且在培養基傾注時霉菌孢子易受熱損傷。

    3、培養基的選擇：

    培養基的選擇應根據實驗材料和檢驗目的來確定。目前國標方法中使用的培養基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、孟加拉培養基(RBC)、高鹽察氏培養基(CAO)，其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長，而CAO則適合于高滲性霉菌生長，酵母菌幾乎不長。

    在日常檢測中我們發現，有些常見的耐高滲性霉菌，如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生長非常緩慢或不長，而這些菌在高滲培養基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方：蔗糖400g，麥芽提取汁20g，酵母提取汁5g，瓊脂20g，氯l霉素50mg，蒸餾水1000ml；DG18瓊脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，氯l霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，PH6.5)上則正常生長。孢子、形態特征發育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長，因此，若能同時采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養各類樣品中的霉菌，將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時采用M40Y或DG18。

    由于霉菌中很多種類不會產生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數量不多，但其產生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計數并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。

    為此，國外有些研究者設計出各類選擇性培養基，可以識別產毒的霉菌。如AFPA培養基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產生菌高污染率的食品。產黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培養2~3天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識別。有人利用該培養基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿意的結果。因此,針對不同樣品,有目的地設計出相應的選擇性培養基,以篩選污染菌中的危險菌群,將是一個值得探索的方向。

    4、培養基配制時應注意的問題：

    (1)滅菌溫度要嚴格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養基溫度不應太高，過高會導致糖分焦化，影響質量；

    (2)瓊脂培養基不能反復溶化。反復溶化會破壞培養基中的營養成分；

    (3)培養基不能反復滅菌，反復滅菌也會導致營養成分的破壞；

    (4)含瓊脂的培養基滅菌后，要搖勻。

    5、平板的保存：

    大多數平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、顯色系列等要避光低溫保存。

    6、產品的保存：

    (1)干粉培養基：避光干燥，結塊后不能使用。

    (2)亞碲酸鉀卵黃增菌液、50%卵黃乳液等：冷凍保存，使用時，要常溫解凍，避免水浴加熱。

    (3)抗生素類：冷藏保存，溫度過高會導致靈敏度的下降。

    (4)兔血漿：冷藏保存少量的紅色不會影響結果。

    7、添加劑的添加：

    （1）溫度的掌握。卵黃和抗生素類添加的溫度都不應太高。

    （2）定量。過多會抑制一些目標菌，太少又導致雜菌的過度生長。

    8、培養溫度的掌握：

    （1）真菌類。25-28℃培養

    （2）細菌類。李氏菌在增菌和生化中要求培養溫度在30℃左右。

    （3）其他，一般在36℃左右。

    9、接種方法：

    常用的方法主要有劃線、三點接種、穿刺接種、傾注接種、涂布接種、液體接種。

    10、革蘭氏染色方法：

    染色時間的掌握、沖洗的方法。

    11、生化實驗：

    （1）接種的方法

    （2）氧化型和發酵型實驗操作

    （3）陽性菌種的對照

    （4）接種前的純化。挑取單個菌落進行一系列的生化。

    12、最適計數范圍

    霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當擴散，在直徑9cm的平皿里，菌落數稍多就相互交叉重疊，影響計數，但數量太少又會產生較大的誤差，因此選擇適當的稀釋度計數是保證結果準確的關鍵環節之一。

    我們對這方面作了一些觀察研究，首先是將實驗菌株的斜面培養物制成含有約106個/ml的孢子懸液，并用血球計數器在顯微鏡下準確計數，然后將孢子懸液作10-1~10-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25℃培養5天后計數。30種常見霉菌的兩種不同計數方法所得結果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個菌落的稀釋度時的計數與顯微鏡計數結果最z接近；有近一半的菌株，每個平板含50~100個菌落已較難計數，而大部分菌株，超過100個/平皿或小于10個/平皿的計數結果就與顯微計數結果存在較大差別，因此，應盡量選擇10~50個/平皿的稀釋度進行霉菌計數。

    而對上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應在更少的范圍內計數(30個/平皿以內)。為控制霉菌的生長速度和菌落的生長范圍，可在培養基中添加少量抗生素，如氯l霉素(50~100mg/L)，金霉j素(20~100mg/L)，慶大m霉素(50mg/L)，土霉m素(100mg/L)等。

    13、關于殺菌的幾個概念：

    （1）抑制：是在亞抑制劑量因子作用下導致微生物生長停止，但在移去這些因子后生長仍可以恢復的生物學現象。

    （2）死亡：在致死劑量因子的作用下或在亞致死劑量因子長時間的作用下，導致微生物生長能力不可逆喪失，即使移去這種因子后生長仍不能恢復的生物學現象。

    （3）防腐：在某些化學物質或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施，它能防止食物腐敗或防止食物霉變。

    （4）消毒：利用某種方法殺死或滅活物質或物體中所有y病原微生物的一種措施，它可以起到防止感染和傳播的作用。

    （5）滅菌：利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內的所有y病原微生物的一種措施。

    （6）化療：利用具有選擇毒性的化學物質，例磺胺、抗生素等對生物體內部被微生物感染的組織或病變細胞進行治療，以殺死組織內的病原微生物或病變細胞，但對有機體無毒害作用的治療措施。